2.1 Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan adalah memberikan zat warna pada sel ataupun bagian-bagiannya sehingga menambah kontras agar tampak lebih jelas. Adapun fungsi dari pewarnaan adalah (Pelczer, 2006) :
a. Menunjukkan bagian-bagian sel.
b. Membedakan mikroba yang satu dengan yang lainya.
c. Untuk mengenal sifat-sifat dari mikrorganisme.
Bakteri berasal dari bahasa latin bacterium (jamak/bacteria) adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangat kecil (miskroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus atau inti sel, cytoskleton, dan organ yang lain seperti mitokondria dan kloroplas (Pelczer, 2006).
Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Bakteri tersebar atau berada di tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Kebanyakan patogen merupakan bakteri, berukuran kecil (0,5 – 5 milimikron). Pada umumnya memiliki dinding sel seperti sel hewan dan jamur, banyak dari mereka bergerak menggunakan flagela yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain (Pelczer, 2006).
2.2 Macam – Macam Pewarnaan
Beberapa pewarnaan yang sangat penting dan sering digunakan untuk pewarnaan pada bakteri yaitu :
a . Pewarnaan Sederhana
Pemberian warna pada bakteri atau jasad renik lain dengan cara menggunakan larutan tunggal suatu zat pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah difikasi, dinamakan dengan pewarnaan sederhana. Lapisan tadi digenangi dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu, kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas pengisap. Biasanya sel-sel itu terwarnai secara merata. Akan tetapi pada beberapa organisme, terutama zat pewarna itu biru menthylen, beberapa granula di dalam sel tampak terwarnai lebih gelap ketimbang bagian-bagian sel lainya (Pelczer, 2006).
b . Pewarnaan Negatif
Pewarnaan Negatif adalah pemberian warna secara tidak langsung terhadap bakteri, karena yang diwarnai hanya latar belakangnya sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewaranaan. Pada pewarnaan ini tidak dilakukan fiksasi (pemanasan) sebab digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena sel bakteri praktis tidak mengalami perubahan (Pelczer, 2006).
c . Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan Diferensial adalah proses pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Pada teknik ini, biasanya digunakan lebih dari satu zat pewarna (Pelczer, 2006).
d . Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram - negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 –1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Anonim, 2008).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan ini ialah ; Crystal Violet, Lugol’s Iodine, Alkohol, dan Safranin atau pewarna tanding yang sesuai (Pelczar, 2006).
Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi dalam 2 kelompok yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri . Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel (Anonim, 2007).
2.2.1 Teknik Pewarnaan
Langkah – langkah utama dalam mempersiapkan sampel mikroba yang akan diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik adalah : (Anonim, 2007).
a. Penempatan olesan atau lapisan tipis mikroba pada objek glass.
b. Fiksasi olesan itu pada objek glass, biasanya dengan pemanasan yang menyebabkan mikroorganisme ini melekat pada objek glass.
c. Aplikasi pewarnaan tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna diferensial (Anonim, 2007).
1. Zat Warna yang Digunakan Pada Pewarnaan Bakteri
Zat warna yang biasanya digunakan pada pewarnaan adalah berupa garam-garam yang terdiri dari ion bermuatan positif dan ion yang bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini dapat digunakan untuk membedakan bakteri-bakteri, karena reaksi pewarna dengan sel bakteri akan memberikan hasil yang berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar dari pewarnaan bakteri. Zat warna ini dapat dibedakan menjadi 2 yaitu pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya methylen biru, kristal violet, safranin dan lain-lain (Anonim, 2007).
2. Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor sebagai berikut menurut (Pelczer, 2006).
a. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum dilakukan pewarnaan bakteri yang berfungsi untuk: (Pelczer, 2006).
1. Melekatkan sel bakteri pada kaca objek.
2. Membunuh bakteri, karena sel-sel yang mati lebih mudah diwarnai.
3. Melepaskan butiran protein menjadi gugus reaktif (NH3 +) yang akan
bereaksi dengan gugus OH dari zat warna.
1. Membuat sel-sel lebih kuat.
2. Mengubah daya ikat zat warna. (Pelczer, 2006).
b. Peluntur Zat Warna
Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang telah diwarnai. Pelunturan zat warna digunakan untuk menghasilkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah dilunturkan zat warnanya (Pelczer, 2006).
