DEFENISI GENETIKA
Genetika berasal dari Bahasa Latin GENOS yang berarti suku bangsa atau asal usul. Dengan demikian genetika berarti ilmu yang mempelajari bagaimana sifat keturunan ( hereditas ) yang di wariskan kepada anak cucu, serta variasi yang mungkin timbul di dalamnya. Menurut sumber lainnya, Genetika berasal dari Bahasa Yunani GENNO yang berarti melahirkan.Dengan demikian genetika adalah ilmu yang mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun suborganisme (seperti virus danprion).. Unit keturunan disebut gen,adalah suatu segmen DNA yang nukleotidanya membawa informasi karakter biokimia atau fisiologis tertentu. Pendekatan tradisional pada genetika telah mengidentifikasikan gen sebagai dasar kontribusi karakter fenotip atau karakte dari keseluruhan stuktural dan fisiologis dari suatu sel atau organisme, karakter fenotip Apada bakteri, pada umumnya di amati pada tingkat organisme. Dasar kimia untuk variasi daam fenotip, atau perubahan urutan DNA dalam suatu gen atau dalam organisasi gen.(Jawets, 2001).
Gen menumbuhkan serta mengatur berbagai jenis karakter dalam tubuh baik fisik maupun psikis. Pengaturan karakteristik ini melalui proses sintesa protein seperti; kulit dibentuk oleh keratin, otot dari aktin dan miosin, darah dari (Hb, globulin, dan fibrinogen), jaringan pengikat dari (kolagen dan elastin), tulang dari Ossein, tulang rawan dari kondrin. Gen sebagai factor keturunan tersimpan di dalm kromosom, yaitu di dalam manik – manic yang disebut kromomer atau nukleusom dari kromonema. Morgan seorang ahli genetika dari Amerika Serikat menyebut kromomer itu dengan lokus. Lokus adalah lokasi yang diperuntukan bagi gen dalam kromosom. Jadi menurut morgan gen tersebut tersimpan di dalam setiap lokus yang khas dalam kromosom. Gen sebagai zarah kompak yang mengandung satuan informasi genetic dan mengatur sifat – sifat menurun tertentu memenuhi lokus suatu kromosom. Setiap kromosom mengandung banyk gen. Oleh sebab itu, dalam setiap kromosom khususnya di dalam kromonema terdapat deretan lokus. Batas antar lokus yang satu dengan lokus yang lain tidak jelas seperti deretan kotak – kotak Pada saat itu DNA sudah ditemukan dan diketahui hanya berada pada kromosom (1869).
· Organisasi Gen
a. EUKARIOTA
· Struktur DNA/RNA
1-2 kromosom linear terpisah dari sitoplasma Berada dalam membran inti Sel diploid / haploid
· Replikasi
Pada titik tumbuh atau ujung kromosom Proses mitosis & meiosis bergerak ke segala arah (semikonservatif) “ori”- ”ter”
b. PROKARIOTA
· Struktur DNA/RNA
DNA sirkuler (kromosom +plasmid)/Replicon Tidak mempunyai membran inti Transposon untuk migrasi dapat terjadi insersi(750-2000 kbp)
• Replikasi
Dimulai dari suatu titik
· Replikasi DNA
Replikasi, yaitu proses peng-copy-an DNA induk untuk menghasilkan molekul DNA anak yang mempunyai urutan nukleotida yang identik. Proses yang kedua adalah transkripsi, yaitu proses dimana kode genetik yang terdapat dalam DNA di copy menjadi molekul RNA. Proses yang ketiga adalah translasi, dimana pesan genetik yang dikode dalam messenger RNA di translasi dalam ribosom menjadi polipeptida dengan urutan asam amino tertentu.Setelah James Watson dan Francis Crick menemukan struktur DNA pada tahun 1953, bagaimana peran DNA sebagai templat untuk replikasi dan transmisi informasi genetik menjadi jelas: rantai yang satu merupakan komplemen dari rantai yang lain. Aturan pasangan basa memberikan arti bahwa masing-masing rantai berfungsi sebagai templat untuk sintesis rantai pasangannya.
1. Replikasi DNA semi-konservatif
Replikasi DNA bersifat semi-koservatif, artinya satu molekul DNA untai ganda bereplikasi untuk menghasilkan dua molekul DNA baru yang identik. Masing-masing molekul DNA baru itu terdiri dari satu rantai DNA lama dan satu rantai DNA baru (Gambar 1). Pada replikasi DNA, mula-mula kedua untai DNA terpisah, kemudianmasing-masing untai berfungsi sebagai templat untuk sintesis untai DNA yang baru, sehingga proses replikasi menghasilkan dua molekul DNA baru, masing-masing memiliki satu rantai lama dan satu rantai baru.
|
 |
|
Di dalam rantai DNA, titik awal dimulainya replikasi DNA disebut sebagai ori (‘origin of replication”). Pada bakteri Escherichia coli, replikasi dimulai dari oriC, suatu urutan DNA spesifik yang terikat pada membran sel bakteri. Replikasi DNA berlangsung ke dua arah. Helikase merupakan enzim yang memisahkan kedua untai DNA pada proses replikasi DNA in vitro. Dalam molekul DNA rantai panjang, replikasi terjadi pada potongan-potongan rantai pendek dan kedua rantai DNA induk
Di dalam rantai DNA, titik awal dimulainya replikasi DNA disebut sebagai ori (‘origin of replication”). Pada bakteri Escherichia coli, replikasi dimulai dari oriC, suatu urutan DNA spesifik yang terikat pada membran sel bakteri. Replikasi DNA berlangsung ke dua arah. Helikase merupakan enzim yang memisahkan kedua untai DNA pada proses replikasi DNA in vitro. Dalam molekul DNA rantai panjang, replikasi terjadi pada potongan-potongan rantai pendek dan kedua rantai DNA indukterpisah hanya pada titik awal replikasi membentuk molekul seperti huruf Y yang biasa disebut ’fork’ replikasi.
Rantai DNA baru tumbuh dalam arah 5’→3’ dengan penambahan molekul deoksiribonukleotida pada gugus 3’-OH. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim DNA polimerase. Karena kedua rantai DNA adalah antiparalel, rantai yang berperan sebagai templat dibaca dari ujung 3’ kearah 5’. Jika sintesis selalu berlangsung dengan arah 5’→3’ bagaimana kedua rantai bisa disintesis secara serentak? Jika kedua rantai disintesis secara kontinu selama fork replikasi bergerak, salah satu rantai akan mengalami sintesis dengan arah 3’→5’. Masalah ini dijelaskan oleh Reiji Okazaki pada tahun 1960. Okazaki menemukan bahwa satu rantai DNA baru disintesis dalam bentuk potongan-potongan pendek yang disebut ”fragmen Okazaki”. Jadi satu rantai DNA baru disintesis secara kontinu, dan rantai lain secara diskontinu. Rantai yang disintesis secara kontinu atau ’leading strand’ adalah rantai yang sintesis 5’→3’nya berlangsung dengan arah yang sama dengan pergerakan fork replikasi, sedang rantai diskontinu atau ’lagging strand’ adalah rantai yang sintesis 5’→3’-nya berlangsung berlawanan dengan arah pergerakan fork replikasi (Gambar 2). Panjang fragmen Okazaki berkisar antara ratusan sampai ribuan nukleotida, tergantung pada tipe sel. Fragmen Okazaki kemudian disambungkan oleh enzim DNA ligase.
Gambar 2 : Proses replikasi dan fragmen Okazaki
2. Reaksi polimerisasi DNA
Untuk reaksi polimerisasi DNA diperlukan DNA templat, substrat yang terdiri dari ke empat macam deoksiribonukleosida trifosfat (dNTP) yaitu: dATP, dGTP, dCTP dan dTTP), enzim DNA polimerase dan primer, suatu oligonukleotida yang sudah berpasangan dengan templat. Basa dari dNTP berpasangan (membentuk ikatan hidrogen) dengan basa komplemen yang sesuai pada templat. Reaksi yang terjadi adalah serangan nukleofilik oleh gugus 3’-OH dari nukleotida pada ujung 3’ rantai yang sedang tumbuh terhadap 5’-α-fosfat dari dNTP yang datang, membentuk ikatan fosfodiester. Pada reaksi ini satu molekul pirofosfat dilepaskan (Gambar 3).
Gambar 3. Reaksi polimerisasi. P = gugus fosfat; A = adenin; T = timin;
C = sitosin; T = timin; PPi = pirofosfat
Penelitian tentang DNA polimerase I E. coli, telah menjelaskan bahwa semua DNA polimerase memerlukan DNA templat. Reaksi polimerisasi diarahkan oleh rantai DNA templat sesuai dengan aturan pasang basa Watson-Crick, contohnya bila Guanin terdapat pada templat maka Cytosin ditambahkan pada rantai baru. Disamping itu, DNA polimerase memerlukan primer. Primer adalah rantai oligonukleotida (yang komplemen dengan tempat) dengan ujung 3’OH bebas, sehingga nukleotida bisa ditambahkan. Ujung 3’ yang bebas pada primer disebut terminal primer. Dengan kata lain sebagian dari rantai baru yang akan disintesis harus sudah ada. Semua DNA polimerase hanya bisa menambahkan nukleotida pada rantai yang sudah ada. Primer biasanya merupakan oligonukleotida RNA yang disintesis oleh enzim primase (Gambar 4).
Disamping DNA polimerase yang mensintesis DNA, dalam sel juga terdapat enzim nuklease atau DNase yang bekerja mendegradasi DNA. Nuklease dibagi menjadi dua kelas : eksonuklease dan endonuklease. Eksonuklease mendegradasi asam nukleat dari ujung-ujung molekul. Pada umumnya bekerja dengan arah 5’→3’ atau 3’→5’, membuang nukleotida dari ujung 5’ atau 3’. Endonuklease dapat mendegradasi DNA dari sisi tertentu di dalam rantai DNA sehingga menghasilkan fragmen yang lebih kecil. Terdapat beberapa kelas endonuklease penting yang memotong polinukleotida pada posisi tertentu, yang disebut endonuklease restriksi. Enzim ini sangat penting pada teknologi DNA rekombinan.
· TRANSFER DNA
• Enzym restriction : untuk memotong DNA menjadi fragmen potongan DNA
• Enzym endonuclease : untuk pembatas yang merupakan mekanisme bakteri untuk membedakan DNA sendiri dengan DNA dari sumber biologi lain.
Mekanisme Transfer Gen
1. Konjugasi
satu rantai DNA ditransfer (terutama plasmid).sel donor ikut member energi dan blok pembangun untuk sintesis untai baru DNA, yang secara fisik dipindahkan ke sel penerima.penerima melengkapi struktur DNA untai ganda dengan mensintesis untai pasangannya sebagai pelengkap bagi untai yang diperoleh dari donor.
2. Transduksi
donor DNA dibawa phage dan ditransfer ke resipien dengan mekanisme infeksi phage
3. Transformasi
pemasukan langsung DNA donor ke resipien melalui alami atau dipaksakanrelatif hanya sedikit strain bakteri yang secara alami menjalani transformasi. Strain ini mengasimilasi DNA donor dalam bentuk linear.transformasi yang di paksakan diinduksi dalam laboratorium,setelah di bari garam dengan kadar tinggi dan syok suhu,banyak bakteri menjadi mampu mengasimilasi plasmid ekstrasel.
· Mutasi gen
Mutasi adalah perubahan di dalam rangkaian nucleotide suatu gen. ini menimbulkan ciri genetis yang baru, atau genotype yang berubah. Mutasi mencakup penggantian basa (substitusi), penghapusan (delesi), penyisipan (insersi), dan penyusunan ulang. Suatu sel atau organisme yang memperlihatkan efek suatu mutasi disebut mutan. Berdasarkan tempatnya mutagenesis dapat di bagi menjadi dua yaitu :
1) Mutasi tingkat gen
Mutasi gen yaitu perubahan pasangan basa pada satu gen. Bila melibatkan satu pasang basa maka disebut mutasi titik. Mutasi titik dapat dibedakan lagi menjadi: subtitusi (penggantian), delesi (penghapusan), insersi (penyisipan) dan duplikasi (pengulangan). Mutasi yang terjadi dalam gen akan merubah kodon sehingga merubah asam amino yang dikode oleh kodon tersebut, sehingga dapat merubah polipeptida. Namun tidak semua mutasi yang merubah kodon akan merubah asam amino, karena adanya asam amino yang di kode oleh beberapa kodon. Mutasi gen dapat juga dibedakan berdasarkan pengaruhnya terhadap kodon, yaitu: mutasi mis-sense (mutasi yang merubah asam amino), mutasi same-sense (mutasi yang tidak merubah asam amino), dan mutasi non-sense (mutasi yang merubah asam amino menjadi stop kodon) (Gambar 5).
Mutasi same-sense tidak akan berpengaruh terhadap fungsi protein. Mutasi mis-sense yang merubah asam amino penyusun protein akan memberikan dampak yang berbeda-beda terhadap protein, tergantung dari posisi asam amino tersebut dalam protein dan sifat asam amino penggantinya. Bila asam amino tersebut tidak berada pada sisi aktif, mungkin tidak akan berpengaruh terhadap fungsi protein, namun bila asam amino tersebut berada pada sisi aktif, dan sifat asam amino penggantinya berbeda, maka mungkin fungsi protein tersebut akan berubah. Sementara mutasi non-sense yang merubah kodon pengkode asam amino menjadi kodon terminasi akan menghasilkan protein yang tidak lengkap. Sehingga protein tersebut menjadi tidak berfungsi dan menyebabkan efek yang serius terhadap organisme.
Mutasi insersi dan delesi satu pasang basa dapat merubah pola pembacaan (reading frame) urutan pengkode polipeptida. Mutasi ini akan merubah asam-asam amino penyusun protein, sehingga protein tersebut tidak akan berfungsi lagi. Mutasi yang merubah pola pembacaan ini dikenal juga dengan istilah mutasi frameshift.
Mutasi dapat terjadi secara spontan, karena ketidak-akuratan proses replikasi. Mutasi juga bisa terjadi karena zat kimia atau beberapa tipe radiasi. Zat kimia yang dapat menyebabkan mutasi disebut mutagen. Beberapa mutagen juga merupakan karsinogen (menyebabkan kanker). Mutagen banyak terdapat disekitar kita. Asap rokok mengandung senyawa mutagen. Afalatoxin yang diproduksi oleh jamur yang tumbuh pada jagung dan kacang merupakan senyawa karsinogen yang sangat potensial. Selain itu makanan yang dibakar seperti barbecue, hamburger mengandung banyak jenis mutagen. Disamping senyawa kimia, beberapa tipe radiasi juga bersifat sangat mutagen. Sebagai contoh sinar X dan sinar gamma dapat menembus sel dan merusak DNA. Sinar UV dengan panjang gelombang tertentu dapat menembus sel kulit dan berinteraksi dengan DNA sehingga menyebabkan perubahan yang signifikan.
2) Mutasi tingkat kromosom
Disebut mutasi kromosom bila perubahan tejadi pada sebagian besar kromosom, bahkan seluruh kromosom. Terdapat tiga tipe mutasi kromosom, yaitu: delesi (hilangnya sebagian daerah pada kromosom), translokasi (perpindahan sebagian daerah antara kromosom yang tidak homolog), dan aneuploidy (jumlah kromosom abnormal).
a. Delesi.
Jarang terjadi pada manusia, bila terjadi akan menyebabkan efek yang serius. Penyebabnya tidak diketahui, namun beberapa peristiwa menyebabkan rusaknya DNA dalam kromosom, sehingga menyebabkan hilangnya beberapa gen. Beberapa penyakit yang disebabkan oleh delesi pada kromosom adalah : retinoblastoma (penyakit kanker mata turunan sejak kecil) dan Wilms’ tumor (kanker ginjal sejak kecil).
b. Translokasi.
Translokasi kromosom terjadi bila terjadi pemotongan dalam kromosom yang homolog dan segmen yang terpotong tersebut berganti tempat. Jika pemotongan terjadi dalam daerah bukan pengkode pada DNA, maka tidak ada informasi genetik yang akan rusak. Sehingga tidak ada perubahan fenotip yang dihasilkan dari translokasi ini. Tapi jika translokasi terjadi dalam daerah pengkode, maka informasi yang dimiliki oleh gen akan rusak. Beberapa penyakit kanker disebabkan oleh translokasi, diantaranya leukemia (kanker darah) dan Burkitt’s lympoma (sejenis kanker di Afrika).
c. Aneuploidy.
Yaitu bila terdapat jumlah kromosom abnormal dalam sel. Aneuploidy yang paling umum adalah trisomy, dimana terdapat tiga copy dari kromosom tertentu di dalam sel. Aneuploidy terjadi pada proses miosis selama pembelahan sel, dimana mekanisme normal pemisahan kromosom gagal terjadi. Trisomy yang paling umum adalah Down Sindrom, yaitu trisomy pada kromosom 21. Down Sindrom terjadi setiap satu dalam 600-700 kelahiran. Terdapat hubungan yang positif antara umur wanita melahirkan dengan insiden Down sindrom. Bila wanita dengan umur 45-50 tahun melahirkan, maka resiko melahirkan anak Down sindrom 50x-60x lebih tinggi.
Beberapa trisomy juga berhubungan dengan kromosom sex. Klinefelter sindrom (terdapat dua copy kromosom X dan satu kromosom Y atau XXY) terjadi setiap satu dalam 700 kelahiran. Orang yang menderita penyakit ini adalah laki-laki tapi memiliki beberapa sifat wanita. Efek fisik dan mental bisa bervariasi, ada yang tidak kelihatan, ada yang mengalami keterbelakangan mental dan ada juga yang mengalami masalah emosi.
Trisomy XYY yang juga terjadi pada laki-laki, ternyata memiliki dampak sosial. Sebuah penelitian menemukan bahwa trisomy ini menyebabkan penyakit mental, keterbelakangan mental, badan tinggi, dan agresif. Penelitian yang dilakukan terhadap trisomy di rumah sakit jiwa dan penjara ini melaporkan bahwa trisomy XYY berhubungan dengan tingkah laku agresif, sehingga media menyebutkan ‘gen kriminal’. Kondisi XYY menghasilkan laki-laki dengan tingkah laku agresif dan sangat suka berbuat kriminal. Namun beberapa penelitian membantah hasil ini sebab terdapat banyak laki-laki trisomy yang hidup normal tanpa menyadari bahwa dia memiliki kelebihan kromosom Y.
· Ekspersi Gen
Genotip DNA diekspresikan sebagai protein yang menjadi molekul dasar untuk fenotip sifat yang diturunkan DNA untuk menjadi protein harus ditranskripsikan menjadi RNA atau untaian tunggal DNA. Jadi DNA menentukan sifat protein yang dihasilkan,secara tidak langsung yaitu melalui pemindahan informasi ke bentuk RNA, yang kemudian memprogram sintesa protein atau translasi RNa ke protein. Jadi pada proses ekspresi gen ada dua tahap penting yaitu transkripsi, suatu proses pemindahan informasi genetis ke molekul RNA, dan Translasi proses transfer dari informasi ke protein.
· Manipulasi DNA klon
Molekul DNA plasmid dan bakteriofog mempunyai sifat-sifat dasar yang ditentukan sebagai wahana kloning, namun sifat ini tidak berguna tanpa adanya tehnik-tehnik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. Ketrampilan dasar untuk melakukan kloning secara sederhana adalah :
1. Preperasi sampel DNA murni
2. Pemotongan DNA murni
3. Analisis ukuran fragmen DNA
4. Penggolongan molekul DNA
5. Memasukan molekul DNA ke dalam sel tuan rumah
6. Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinasi.
· Preparasi fragmen DNA
Ekspresi informasi genetik normalnya melibatkan produksi molekul RNA yang ditranskripsi dari templat DNA. Rantai DNA dan RNA mungkin kelihatan sama, perbedaan hanya terletak pada posisi 2’ pentosa dan penggantian Tymin menjadi Urasil. RNA merupakan satu-satunya makromulekul yang berfungsi untuk menyimpan, mentransmisikan informasi genetik, dan sebagai katalis. Penemuan katalis RNA atau ribozim telah merubah defenisi dari enzim.
Proses sintesis molekul RNA menggunakan DNA sebagai templat disebut transkripsi. Molekul RNA yang disintesis mempunyai urutan basa yang kompelemen dengan salah satu rantai DNA. Proses transkripsi menghasilkan tiga jenis molekul RNA, yaitu : mRNA, tRNA dan rRNA. Messenger RNA (mRNA) merupakan blue print yang mengkode urutan asam amino dari satu atau lebih polipeptida yang terdapat dalam satu gen atau sekumpulan gen. Transfer RNA (tRNA) berfungsi membaca informasi yang dikode oleh mRNA dan mentransfer asam amino tertentu ke rantai polipeptida yang sedang tumbuh selama proses sintesis protein. Molekul ribosomal RNA (rRNA) merupakan komponen ribosom, yang berfungsi sebagai cetakan tempat sintesis protein terjadi.
Gambar 5 . Proses transkripsi, translasi dan assembly
Selama proses replikasi keseluruhan kromosom di-copy, namun transkripsi bersifat lebih selektif. Hanya gen tertentu atau sekumpulan gen tertentu yang ditranskripsi pada suatu waktu tertentu, dan beberapa bagian DNA genom tidak pernah ditranskripsi. Sel membatasi ekspresi informasi genetik untuk membentuk produk gen yang dibutuhkan pada waktu tertentu. Terdapat urutan regulator spesifik yaitu promotor pada awal gen dan terminator pada akhir gen, yang menandakan bagian DNA mana yang akan digunakan sebagai templat. Promotor merupakan urutan pada awal gen yang dikenali oleh RNA polimerase untuk memulai transkripsi, dan terminator merupakan urutan yang memberikan sinyal penghentian transkripsi.
· Pemisahan fisik fragmen DNA
Dalam pemotongan DNA genomik dan DNA vektor digunakan enzim restriksi untuk menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro.
1. Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri (cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket).
2. Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase (cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul).
3. Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
· Analisis dengan DNA klon
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
· Karakterisasi DNA klon
Karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Cara seleksi sel transforman Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu :
1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal,
2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan
3. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, dapat ditentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.
· DNA rekombinan
Gen pengklonan : DNA rekombinan
Bakteri merupakan mesin-mesin efesien untuk untuk menciptakan turunuan identik DNA bacterifogdalam jumlah. Begitu masuk dalam sel imangnya. DNA fag tersebut berlipat ganda berkali-kali, turunan dikemas kedalam partikel-partikel berdaya tulang, baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi daur infeksitersebut. Jika kita adapat menempelkan gen eukariotik kepada molekul DNA fag seperti itu, maka dapat direflikasi dengan cara yang sama sekali lagi endonukliase restriksi memungkinkan musliaht itu. Ekori adalah endonuklease resttriksi yang dihasilkan oleh “E. koli” . enzim ini membelah DNA hanya ditempatyang meliputi rangkaiannya. Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buangin dan adenin. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan filman ganda itu membaawa panjang tambahan emapt nukleotida. DNA yang berpasangan (berhelai tunggal), yang dinamai ujung “lengket” karena mapu berpasangan basa dengan molekul DNA yangmanapun mengandung ujung lengket pelengkap. Gagasannya adalah memperlakukan kedua DNA eukariotik dan DNA bakteriopag dengan endonuklease retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-ujung pelengkap pada masing-masing.Dalam keadan yang sesusai, secara bercampur molekul-molekul DNA eukariotik akan menempel pada molekul-molekul DNA dengan ujung-ujung lengketnya masingmasing.
Kemudian DNA ligase dapat dipakai untuk mengaitkan secara kovalen molekul-molekul itu bersama. Beberapa dari hibrid atau molekul-molekul rekombinan ini akan tetap berdaya infeksi pada inang bakteriofognya (ekoli) sebagaimana bakteriofog yang normal. Hal ini dapat dideteksi dengan membiarkan ekoli terbuka bagi campuran molekul DNA rekombinan dan selanjutnya menabur selsel pada cawan fetri berisi agar. Sel-sel bakteri itu mulai berkembang biak,membentuk selaput sel-sel dipermukaan agar. Akan tetapi, setiap sel yang secara,berhasil diinfeksi oelh molekul-moleku DNA rekombinan akan membentuk banyak turunan baru DNA rekombinan tersebut sebelum dibunuh dan dilisis.Molekul-molekul yang infektif dilepas, menginfeksi sel-sel terdekat, dan proses itu diulang.
Akibatnya segara nampak pada mata dengan mata telanjangsebagai zona atau plak sikular yang jernih pada “padang” sel-sel . setiap plakmerupakan suatu “flon” molekul-molekul DNA dan dapat diriakkan secara tak terbatas dengan meninfeksi lebih banyak sel ekoli. Walau setiap plak (plague) menghasilkan ikon unit molekul-molekul DNA rekombinan, potongan “dari DNA” eukariotik yang ada pada plak tertentu merupakan kebetulan semata-mata. Pencernaan semua DNA dalam sel-sel organisme eukariotik seperti mencit atau tikus oleh oleh endonuklease restriksi menghasilkan kumpulan fragman DNA yang sangat beragam. Fragman-fragman ini tergabung pada DNA bakteriofag secara acak semata-mata. Pengklonan fragmen yang merupakan seluruh genam suatu organisme dinamakan pengklonan “senapan”.Kini masalahnya adalah salah satu temuan dari satu atau lebih plag (mungkin dari beberapa ribu ) yang mengandung gen edukariotik yang menarik perhatian kita. Untuk ini diperlukan suatu “tolok”. Misalnya kitya mencari DNA kelinci yang menjadikan lantai-lantai hemoklobinnya. Sebagaimana kita ketahui, RNA pesuruh untuk rantai-rantai ini dapat diisolasi dari prekursor sel-sel darah merah kelinci.Pesuruh-pesurh ini dapat diisolasi dari prekursor dan dapat diberi label isotop radio aktif dan digunakan untuk mencari plak-plak yang mengandung rangkaian DNA pelengkap, yaitu rangkaian DNA yang dari pada pesuruh-pesuruh hemoglobin ini ditranskripsi. Inilah prosedurnya, sehelai kertas saring yang dibuat dari nitro selulosa secara perlahan ditekan pada permukaan lempengan agar yang berplak.
Beberapa dari DNA pada setiap plak diserap oleh kertas saring tadi. DNA yang terserat itu kemudian diubah sifatnya menjadi pelayan tunggal, dan kertas saring yang dicelupkan kedalm kedalam larutan yang berisikan molekul-molekul DNA rekombinan yang menyatakan rangkaiannya yang dicari itu. Karena plak-plak asal tidak menjadi rusak karena prosedur ini, maka molekul-molekul tambahan sampelkhusus DNA rekombianan itu dapat dibiakkan dalam sel-sel “koli” tambahan untukmemproduksi sebanyak turunan sampelnya yang diinginkan.Maka inilah satu cara (namun bukan satu-satunya cara) untuk mencapaitujuan terdekatnya yaitu sampel murni suatu gen eukariotik. Prosesnya mungkintanpak rumit, tetapi sungguh sangat langsung dan akhirnya tujuan dapat diacapai.
· Rekayasa Gen
Rekayasa Genetika/ pencangkokkan gen (DNA Rekombinan) merupakan kemajuan yang paling muktahir abad ini. Merupakan strategi untu memindahkan bagian kecil dari informasi genetika (DNA) dari satu organisme ke organisme lain. Tahun 1980, seorang wanita 37 tahun, pasien diabetes wanita pertama yang disuntik insulin wanita yang dibuat bakteri . Dengan teknik ini rekayasa, para peneliti berhasil memaksa bakteri untuk membentuk insulin mirip insulin manusia. Sehingga insulin yang dulu berasal dari sapid an babi sekarang diganti dengan teknik ini. Yang lebih berkualitas dan lebih murah dari pada insulin dari binatang.
Rekombinasi adalah hasil teknologi atau rekombinasi DNA di laboratorium, dialam pun rekombinasi terjadi. Dengan teknologi DNA dapat diproduksi atau dibuat fragmen tertentu. Enzim digunakan untuk memotong fragmen DNA dan menemmpelkan fragmen DNA ketempat yang diinginkan. Enzim restriksi digunakan untuk memotong fragmen DNA menjadi fragmen-fragmen. Dengan memotong dan menyambung kembali bagian yang diinginkan dapt didesain urutan DNA sesuai kode yang diinginkan atau gen yang diinginkan. Enzim ligase digunakan untuk menyambung antar fragmen DNA. Mutagenesis Terarah
Sintesis oligonukleotida secara kimiawi memungkinkan peneliti untuk melakukan subtitusi basa secara terkendali kedalam suatu urutan DNA. Subtitusi tertentu dapat digunakan untuk mempelajari efek mutasi pada ekspresi gen, untuk memeriksa peran asam amino yang diganti dalam fungsi protein, atau berdasarkan informasi mengenai residu yang penting untuk fungsi untuk menonaktifkan suatu gen. Oligonukleotida beruntai tunggal yang mengandung mutasi khusus disintesis secara kimia dan dihibridasikan dengan DNA bakteriofaga beruntai tunggal, yang membawa urutan tipe normal sebagai sisipan. DNA yang dihasilkan, sebagian beruntai ganda, diubah secara enzimatik menjadi bentuk replikatif yang sepenuhnya beruntai ganda. DNA ini, yang mengandung urutan tipe normal pada satu untai, dan urutan mutan pada untai yang lain, digunakan untuk menginfeksi bakteri inang melalui transformasi. Replikasi akan mengakibatkan pemisahan DNA tipe normal dari DNA mutan, dan gen mutan untai ganda dapat diisolasi kemudian diklon dari bentuk replikatif faga.
Sintesis oligonukleotida secara kimiawi memungkinkan pembentukan gen sintesis yang mengandung tempat restriksi yang tersebar luas, sehingga dapat terjadi penggantiaan secara moduler urutan DNA yang menyandikan protein mutan. Mutasi ganda dapat dengan mudah dimasukkan. Pada dasarnya, suatu sifat yang dikehendaki dapat dipertahankan, sementara sifat yang tak dikehendaki dapat dihilangkan.
Jawets E, Joseph M & Edward A . 1996 . Mikrobiologi Kedokteran . Jakarta : EGC
Tidak ada komentar:
Posting Komentar